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Acidi nucleici


The ideal tecnique
 

  • SENSIBILE 100% (nessun falso negativo) (rileva "tutto")
  • SPECIFICA 100% (nessun falso positivo)  (rileva "solo")
  • Sicura (nessun composto tossico e pericoloso)
  • Economica (reagenti e strumenti poco costosi)
  • Veloce (ore/uomo)
  • Semplice (di facile esecuzione)

    •  

     

    METODI PER L'ESTRAZIONE DEGLI ACIDI NUCLEICI

    Methods - una raccolta di link ai siti che trattano dei metodi impiegati in genetica molecolare.

    1) Nessuna estrazione
    2) Estrazione

    Spettro di applicazione:

    tipo di cellule, tessuto, specie, etc

    1) Tessuti umani
    2) Organismi impiegati per il clonaggio di geni umani
    Quantità del materiale recuperato
    Qualità del materiale recuperato

    * assenza di degradazione
      (indotta dalla metodica)

    * assenza di prodotti contaminanti

    * Funzionalità del materiale recuperato
     

    Fasi della estrazione degli acidi nucleici

    Importanza della conoscenza delle basi razionali dei metodi impiegati.
    Racconto "Cromo" di Primo Levi.

    Separazione cellulare
    Lisi cellulare (detergenti; enzimi; agenti caotropici) - [Precauzioni contro le RNasi]
    Dal lisato si può recuperare il DNA secondo tre modalità fondamentali:
     

    1) Solventi organici

    Estrazione (solvente apolare)
    Precipitazione
    Sali (cationi)
    Solvente (solvente moderatamente apolare)
    Temperatura
    Gravità
    Carrier
    Lavaggio
    Sospensione

    Esempio con reagenti "fatti in casa":
    http://teach.genetics.utah.edu/content/labs/DNA_Extraction.pdf
    Simulatore:
    http://learn.genetics.utah.edu/content/labs/extraction/

    2) Affinità (glass beads)

    Gli acidi nucleici vanno a legarsi sulla superficie di particelle di vetro o di gel di silice in presenza di alte concentrazioni di sali caotropici (NaI, GuSCN).
    La eluizione degli acidi nucleici si ottiene con soluzioni a bassa concentrazione salina.
     

    3) Scambio ionico (ionic exchange: Qiagen resin)

    In determinate concentrazioni saline, una matrice cromatografica con cariche positive permette il legame e la ritenzione delle molecole di acido nucleico caricate negativamente.
     
     

    Controllo della estrazione degli acidi nucleici
     

    1. Controllo della qualità

    Elettroforesi su gel

    Agarosio vs. Acrilamide.
    Omogeneità della corsa.

    Elettroforesi: Numeri notevoli

    • Esistenza dell'acido nucleico.
    • Dimensioni dell'acido nucleico: DNA, >20 kb   |   RNA: bande 28S e 18S
    • Integrità dell'acido nucleico (assenza di degradazione).


    Esempi: DNA (1);     RNA (1); RNA (2)

    Spettrofotometro
    Purificazione (rapporto con proteine, 260 nm/280 nm: 1.8)



    2. Stima della quantità

    Elettroforesi su gel

  • Stima relativa a bande di Marcatore

    • Spettrofotometro

  • Stima per assorbanza



    • 3. Verifica della funzionalità
     

    Reazioni enzimatiche (ad es., digestione)

     

    Organizzazione delle estrazioni di DNA e RNA

    Schedatura
    Banca
    Conservazione

    Diagnostica clinica
    (genomico, mitocondriale, virale)

    Saliva
    Sangue
    Liquidi corporei
    Tamponi boccali, nasali, faringei, oculari...
    Tessuti
    Capelli
    Sperma

    Problemi legali - consenso informato (esempio)
     

    Numeri utili

    Una cellula umana diploide contiene circa 3,3x2 (ca. 7) pg di DNA.

    1 mL di sangue periferico umano contiene ˜6-7 x 10e6 globuli bianchi.

    Massimo recupero teorico di DNA: 40-50 mcg/mL di sangue.

    Quantità di DNA impiegata per il Southern blot: 5-10 mcg.

    Quantità di DNA impiegata per la PCR: 0.1 mcg.

    DNA