Mutazione: un�alterazione ereditabile nella sequenza del DNA.

Polimorfismo: l�esistenza in una popolazione di due o più alleli con frequenze significative.

RICERCA DI MUTAZIONI GENICHE

1) Anamnesi familiare, esame clinico
 

2) Scelta del gene (o dei geni da studiare)

1) Gene noto: analisi accurata della letteratura e dei dati disponibili sulla sequenza del gene,
e sulle mutazioni descritte (OMIM; Cardiff)

2) Gene candidato sulla base della fisiopatologia molecolare o su base posizionale

Tenere presente in ogni caso che:
una malattia può essere causata da più geni
un gene può causare diverse malattie a seconda della mutazione
una mutazione può causare diverse malattie a seconda del contesto
gene mutato + contesto genomico [reti] + ambiente = malattia
 

3) Scelta della regione o delle regioni da amplificare per l�analisi (su mRNA, DNA )
 

4) Scelta del metodo o dei metodi da usare (normalmente basati su primers* per PCR )

MUTAZIONI NOTE 
 

  • PCR: Presenza/assenza del prodotto
  • Dimensioni del prodotto di amplificazione
  • PCR allele-specifica
  • Ibridizzazione
  • Enzimi di restrizione
  • Oligonucleotide-ligation assay (OLA-PCR)

    •  

     

    MUTAZIONI IGNOTE 

    Ricerca di errori di appaiamento (mismatch)
     

  • Elettroforesi degli eteroduplex
  • Modifiche di mismatch: enzimatiche, chimiche
  • Instabilità termica ("Denaturing gradient gel electrophoresis", DGGE)
  • "Denaturing high performance liquid chromatography" (DHPLC)

    •  

     

    Analisi del DNA a filamento singolo
     

  • Polimorfismi della conformazione del filamento singolo (SSCP)
  • Sequenziamento
  • "Dideoxy-Fingerprinting" (ddF)
  • Microchip

    •  

     

    5) Conferma "tecnica" dei risultati (definizione della variazione di sequenza)
     

    6) Interpretazione Biologica dei risultati: analisi di sequenza*
     

    Modelli di sequenza e struttura - N.B.: Relazione non ovvia tra:
    - mutazione e prodotto (es. 5´UTR, Kozak, splicing, 3´UTR etc)
    - prodotto genico e malattia (es. Diamond-Blackfan Anemia)

    Genomica funzionale (effetti sul prodotto/i, sulle cellule, sull�organismo)
     

    7) Interpretazione Medica dei risultati: relazione genotipo/fenotipo

    Studio familiare - Studio di popolazione - Studio di SNP

    DNA