Primers per PCR

* min 100 bp

* max 2-4 kb per amplificazione (OK fino a 1,5 kb)

* max 200-300 (400) bp se i prodotti saranno sottoposti a screening mutazionale

* max 700 bp se i prodotti saranno sottoposti a sequenziamento diretto
 

3) Usare Primer-BLAST per progettare i primers nella regione scelta.

Identificare la regione da amplificare con il parametro:
Targets

Eventualmente impostare le dimensioni del prodotto con il parametro:
Product size ranges

Scegliere la lunghezza di ciascun primer (18-25 basi).
La lunghezza può essere impostata con il parametro:
Primer size

Validita' "biochimica" dei primers:

E' meglio posizionare una G oppure una C all’estremo 3', ed evitare una T. Parametro:
GC Clamp (numero di C/G all'estremo 3')

Il contenuto del primer in GC dovrebbe essere del 45-55%. Parametro:
Primer GC%

La temperatura di melting dei due primer dovrebbe essere >55°C, e simile per i due primers. Parametro:
Primer Tm
(regola del 4+2: Tm=[(G/C x 4°C)+(A/T x 2°C)]
Si consiglia: Tm=72°C, con Ta=68°C

Ridurre la autocomplementarità della sequenza di ciascun primer,
e la complementarità della sequenza tra i due primers. Parametro:
Max Self Complementarity (8)
Max 3' Self Complementarity (3)
 

4) Verificare la validità "biologica" dei primers tramite il servizio BLASTN
per cercare eventuali somiglianze con altre zone oltre quella attesa, nella stessa regione o nell'intero genoma.
 

5) Verificare la sequenza del prodotto di amplificazione previsto

* simulazione di digestione se si prevede l’uso del prodotto per:
- ricerca di mutazioni con enzimi di restrizione
- clonaggio in vettore

* simulazione di ibridizzazione (con BLAST) se si prevede l’uso del prodotto per:
- marcatura e impiego come sonda in Northern o Southern blot
 

DNA