PCR PRIMER DESIGN

1) Scegliere la strategi:

zona da amplificare?

Da RNA (scegliere un tratto che comprenda parti di almeno due esoni)?

Oppure da DNA?

2)Dimensioni della regione da amplificare?

Æ min 100 bp

Æ max 2-4 kb per amplificazione (OK fino a 1,5 kb)

Æ max 200-300 (400) bp se i prodotti saranno sottoposti a screening mutazionale

Æ max 700 bp se i prodotti saranno sottoposti a sequenziamento diretto

3) Iniziare ipotizzando due primers agli estremi della regione scelta.

Tenere un margine di ~20 basi tra l’estremo 3´ di ciascun primer e la prima base effettivamente desiderata, nel caso si preveda il sequenziamento della regione amplificata.

• lunghezza di ciascun primer: 18-25 basi

• meglio posizionare una G oppure una C all’estremo 3’, ed evitare una T

• 45-55% G/C content

4) Verificare la validità "biochimica" dei primers tramite software (es. Amplify):

• possono formarsi overlaps tra il primer e se stesso?

• possono formarsi overlaps tra i primers 1 e 2?

• simulando una PCR,

con che probabilità si formerà solo il prodotto atteso?

è possibile se ne formino altri?

• la temperatura di melting dei due primer è >55°C, e simile per i due primers?

(regola del 4+2: Tm=[(G/C • 4°C)+(A/T • 2°C)]

Si consiglia: Tm=72°C, con Ta=68°C

• il primer tende a formare forti strutture secondarie?

Simulazione del ripiegamento presso:

http://www.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold/old/dna/

5) Verificare la validità "biologica" dei primers tramite il servizio BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/),

per cercare eventuali somiglianze con altre zone oltre quella attesa.

6) Verificare la sequenza del prodotto di amplificazione previsto

Æ simulazione di digestione se si prevede l’uso del prodotto per:

- ricerca di mutazioni con enzimi di restrizione

- clonaggio in vettore

Æ simulazione di ibridizzazione (con BLAST) se si prevede l’uso del prodotto per:

- marcatura e impiego come sonda in Northern o Southern blot

FREE SOFTWARE FOR MOL BIO

http://ftp.sunet.se/pub/molbio/docs/biosoft-free.html

 

5. Software listings

This list of over 150 free software programs in molecular biology and related areas is not exhaustive by any means, but includes much of what is

available for Macintosh and/or MS Windows computers.

Operating system key: M - MacOS, W - MS Windows or MS DOS, O - Other (Unix usually)

Software archive abbreviations:

ebi -

ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/software/

iubio -

ftp://iubio.bio.indiana.edu/molbio/

http://iubio.bio.indiana.edu/soft/molbio/

 

Primer design