Progettazione
di
una coppia di primer
per
la amplificazione della regione codificante
dell'mRNA
del
gene SRY (sex determing region on the Y)
SOFTWARE "Primer-BLAST" via web
Copiare la sequenza completa dell'mRNA di
interesse (banca dati Gene).
Incollarla nel programma Primer-BLAST e far proporre al
programma delle coppie di primer,
adatte ad amplificare la regione di interesse all'interno
dell'mRNA.
Delimitare eventualmente la regione di sequenza
intorno alla quale si devono disporre i primer,
inserendo le coordinate iniziali e finali della zona in cui il
programma cercherà una buona sequenza di primer.
Pulsante "Get Primers" per ottenere la
proposta di coppie di primer.
Modificare i parametri cercando di ottenere per tentativi coppie
di primer anche inserendo i parametri migliori e più stringenti.
Copiare e incollare a parte le sequenze delle coppie di primer
migliori ottenute (nel Mac, copia=tasto cmd + c, incolla=tasto cmd
+v).
Usare il programma "Text Edit" dalla raccolta di icone in basso.
Parametri modificabili a piacere:
"Primer size"
(suggeriamo 22-26 basi di lunghezza ideale per ciascun primer).
"Products Size Ranges":
si possono modificare gli intervalli preferiti di lunghezza del
prodotto di amplificazione.
"Primer
GC content": idealmente, 50% (45-55%).
"GC Clamp":
numero di basi all'estremo 3´ che devono essere G o C.
"Max Self Complementarity":
numero di basi autocomplementari, idealmente non più di 5 (e 0
all'estremo 3´).
"Max Pair Complementarity":
numero di basi complementari tra i due primer, idealmente non
più di 5 (e 0 all'estremo 3´).
Ecc.
Verificare la specificità dei primer proposti confrontando
la sequenza di ciascun primer con tutte le sequenze note
(programma BLASTN; restringere la ricerca
ad
Organism: Homo sapiens).
Osservare, oltre alla lista di sequenze complementari al primer
riportate, anche gli allineamenti tra primer e sequenze trovate,
facendo clic sul tab "Alignments" nella pagina web dei risultati
di BLAST.