Progettazione
di una coppia di primer
per la
amplificazione della
regione codificante
dell'mRNA
del gene RPS19 (ribosomal protein S19)
SOFTWARE
AMPLIFY
Copiare la
sequenza di mRNA del gene RPS19 (usare la banca dati "Gene").
Annotare la posizione del codone di inizio e di quello di stop
(ossia i limiti della CDS, o
coding
sequence).
Avviare il
programma Amplify dalla cartella
Applicazioni
(Software) / Molecolare / Amplify.
Occorre fornire
al programma: la Sequenza bersaglio, e i due primer possibili,
quindi si può simulare la PCR.
1) Sequenza
Il comando Open
target sequence dal Menu File apre un file destinato alla sequenza
(premere il
pulsante "Annulla" se richiesto).
Incollare la
sequenza di interesse nella finestra "the sequence".
(Il programma
eliminerà automaticamente gli spazi e i numeri,
al momento della esecuzione della PCR).
2) Primer
Il comando Open
primer list dal Menu File apre un file destinato ai Primer: Primer List
(premere il pulsante
"Annulla"
se richiesto).
Per provare una
coppia di primer:
copiare una
sequenza di circa 25 basi posta a monte della regione da amplificare,
ossia a monte del codone di inizio,
incollarla nella
finestra dei Primer e rimuovere a mano gli spazi e i numeri,
battere il tasto
tab,
poi scrivere un
nome per il primer (ad es.: S).
Quindi copiare
una sequenza di circa 25 basi posta a valle della regione da
amplificare,
ossia a valle del codone di stop,
incollarla nella
finestra dei Primer nella riga sotto
a quella del primer precedente,
rimuovere a mano gli spazi e i numeri,
battere il tasto
tab,
poi scrivere un
nome per il primer (ad es.: AS).
Selezionare
la sequenza di questo secondo primer,
ed eseguire
il comando Reverse sequence dal Menu Sequence.
3) PCR
Indicare al
programma quali primer usare:
fare click sul
primer e scegliere Use
this primer dal Menu Primers.
Questo sposta il
Primer nella finestra "Primers in use".
Se è anche
disponibile una sequenza nella finestra "the sequence",
l'esecuzione del
comando Run
PCR dal Menu PCR simula una PCR.
Osservare i
risultati.
Controllare l'unicità
dei primer con il programma BLASTN.
Una descrizione
di tutti i comandi è consultabile dal Menu Help.
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SOFTWARE "Primer3"
Copiare la
sequenza dell'mRNA contenente
la
regione da amplificare (banca dati Gene).
Incollarla nel programma Primer3
e far proporre al programma delle coppie di primer.
Delimitare eventualmente tra parentesi
quadre.la
regione
di sequenza intorno alla quale si devono disporre i primer.
Parametri modificabili a piacere:
"Primer size"
(suggerite
22-26 basi di lunghezza ideale per ciascun primer);
"Products Size Ranges":
si possono modificare gli intervalli preferiti di lunghezza del
prodotto
di amplificazione.
Verificare la specificita' dei
primer
proposti
confrontando la sequenza di ciascun primer con tutte le sequenze note
(software BLASTN).