Sense primer
Direct primer, Forward primer
Left primer
"Bottom" primer
Primer 1
Antisense primer
Reverse primer, Back primer
Right primer
"Top" primer
Primer 2
1)Strategia
Zona da amplificare - Controllare nelle banchedati: Gene - Dati sui geni
Esercizio: amplificare la CDS ("Coding
sequence") dell'mRNA del gene HBB umano
Scheda nella banca dati "Gene":"Go to reference
sequence details" per ricavare le posizioni della CDS
Scheda nella banca dati "Gene": controllare anche il formato
"Gene Table" (in alto, sceglierlo
invece di "Full Report") OMIM
- Online Mendelian Inheritance in Man - Dati sulle sequenze
alleliche Human Gene
Mutation Database (HGMD) - Cardiff Genome Data
Viewer- Mappa del Genoma Umano presso NCBI
Amplificazione da RNA (scegliere una regione che
include parti di almeno due esoni)
Amplificazione da DNA
2)Dimensioni
della regione da amplificare * min 100 bp
* max 2-4 kb (OK fino a 1.5 kb)
* max 200-300 (400) bp se da sottoporre a "screening" mutazionale
* max 700 bp se da sottoporre a sequenziamento diretto di Sanger
3) Primer-BLAST
- Software per la progettazione di primer
Identificare la regione da amplificare scegliendo il "range" nel
quale deve trovarsi ciascun primer Forward primer -
From... To... Reverse
primer-
From... To...
Scegliere l'intervallo in cui deve trovarsi la dimensione
dell'amplicone:
PCR product size
Indicare un intervallo per la lunghezza dei primer (18-25
nucleotidi):
Primer size
Parametri "Biochimici"
G o C all'estremità 3´; evitare T. Parametro: GC Clamp (numero di C/G
all'estremità 3´)
Contenuto in GC: 45-55%. Parametro: Primer GC%
"Melting temperature" (Tm): dovrebbe
essere >55°C, e simile per i due primer. Parametro: Primer Tm
(Regola del 4+2: Tm=[(G/C x 4°C)+(A/T x
2°C)]
Si consiglia: Tm=72°C, Ta=68°C
Includere la presenza di un introne tra i due primer, se si
amplifica da RNA Intron
inclusion: yes
Intron length range - Verificare la lunghezza degli introni nella
scheda "Gene" - Formato "Gene Table"
Ridurre la autocomplementarità, e la inter-complementarità
tra i due primer. Parametro:
Max Self Complementarity (8 --> 5)
Max 3' Self Complementarity (3 --> 0)
4) Validazione"Biologica"
della sequenza del primer
mediante confronto di sequenze - BLASTN per
verificare la similarità con altre sequenze nella sequenza
genomica completa.
5) (Controllare la sequenza dell'amplicone)
* simulazione di digestione (ricerca di mutazioni; clonaggio
in vettore)
* simulazione di ibridazione via BLAST (marcatura e uso come
sonda in un Northern o Southern blot)
6) DNA Sequencing Il sequenziamento del genoma
umano:
fare click su "How to sequence a genome",
poi fare click sulle animazioni nn. 6, 7, 8 e 9
(Metodo di
Sanger e sequenziamento automatico)
DNA