Progettazione di una coppia di primer

per la amplificazione della regione codificante

dell'mRNA del gene RPS19 (ribosomal protein S19)

SOFTWARE AMPLIFY 3

Copiare l'intera sequenza di mRNA del gene RPS19 (usare la banca dati "Gene"
per trovare la scheda del gene umano per la proteina ribosomiale S19,
quindi fare click sul link NM_001022 che rimanda alla sequenza di mRNA).
Annotare la posizione del codone di inizio e di quello di stop
(ossia i limiti della CDS, o coding sequence).

Avviare il programma Amplify (icona rotonda sulla scrivania con una grande "A" e una provetta).
Chiudere la finestra "Test Target Sequence" (non chiudere la finestra dei primer).

Occorre fornire al programma: la Sequenza bersaglio, e i due primer possibili, quindi si può simulare la PCR.

1) Sequenza

Il comando "New" dal Menu File apre un file destinato alla sequenza

Incollare la sequenza di interesse nella finestra "Untitled".
Fare click sul comando "Format Sequence" dal Menu Sequence per eliminare gli spazi ed i numeri.

Se la finestra "Primer List" non si apre automaticamente,
il comando "Primer list" dal Menu Window apre la finestra dei primer.

2) Primer

Per provare una coppia di primer:
copiare una sequenza di circa 25 basi posta a monte della regione da amplificare,
ossia a monte del codone di inizio.

Nella finestra "Primer List", premere il pulsante "Add Row" e incollare la sequenza nel campo "Sequence".
Scrivere il nome del primer nel campo "Name" (ad es.: "forward").

Quindi copiare una sequenza di circa 25 basi posta a valle della regione da amplificare,
ossia a valle del codone di stop.

Nella finestra "Primer List", premere il pulsante "Add Row" e incollare la sequenza nel campo "Sequence".
Scrivere il nome del primer nel campo "Name" (ad es.: "reverse").

Selezionare la sequenza di questo secondo primer,
facendo clic due volte sul testo della sequenza, assicurandosi che rimanga evidenziato
solo il testo delle basi della sequenza  (e non le altre parti della riga del primer).
ed eseguire il comando "Invert Selection" dal Menu Edit.

3) PCR

Indicare al programma quali primer usare: fare clic sul box di scelta a sinistra della sequenza dei primer.

A questo punto, l'esecuzione del comando "Amplify" dal Menu PCR  simula una PCR.
Non modificare il "Base range" proposto dal programma.
Se il programma rileva la formazione di dimeri di primer, chiede se li si vuole visualizzare:
fare clic su "Yes".

Osservare i risultati.
Il tratto che sarà amplificato appare compreso tra un triangolino blu
(la regione in cui si appaia il primer "forward")
e un triangolino rosso (la regione in cui si appaia il primer "reverse").

L'intensità del colore indica la stabilità del primer,
ossia la qualità del suo legame alla sequenza bersaglio,
che si può verificare facendo clic sui triangolini.
Lo spessore del segmento che simboleggia il tratto amplificato
è indicativo della efficienza della reazione.

Se il prodotto formato risponde a questi requisiti:
- è unico; - non si sono formati dimeri di primer,
si può procedere al passo successivo, altrimenti
cambiare la sequenza di uno o entrambi i primer tornando alla sequenza da amplificare.

E' utile anche visualizzare informazioni sul primer facendo clic sulla riga del primer nella finestra "Primer list",
quindi facendo clic sul pulsante "Primer info".
Se si sono identificati primer adeguati mediante la simulazione con Amplify,
controllare l'unicità della sequenza di ciascun primer rispetto all'intero genoma con il programma BLASTN.
Una descrizione di tutti i comandi è consultabile dal Menu Help.