Richiami di Biochimica dell’RNA
Una cellula di mammifero tipica contiene circa 10^-5 mg di RNA (= 0.01 ng, 10 pg; 1 MCell = 10 mg). Il tipo di RNA più rappresentato è quello ribosomiale (28S, 18S, e 5S), che costituisce l’80-85% dell’RNA totale. La maggior parte del rimanente 15-20% consiste di specie a basso peso molecolare (tRNA, snRNA, etc) (Sambrook et al., 1989). Tutte queste molecole sono caratterizzate dall’avere dimensioni e sequenza ben definite e possono essere isolate mediante elettroforesi su gel, centrifugazione su gradiente di densità, HPLC.

Gli RNA messaggeri invece costituiscono solo l’1-5% dell’RNA cellulare totale. Il campionario degli mRNA quindi è molto eterogeneo per dimensioni (da poche centinaia di basi fino a circa 20.000 al massimo) e per ciò che riguarda la sequenza (ogni mRNA maturo reca la specifica sequenza codificante derivata dall’assemblaggio degli esoni del gene da cui è stato trascritto). Una caratteristica che la grande maggioranza degli mRNA hanno in comune è la presenza all’estremità 3´ di un tratto di residui poliadenilici, il cui significato biologico sembra essere quello di favorire lo splicing, e che generalmente è di lunghezza sufficiente (50-200 residui) per essere sfruttato ai fini di una separazione selettiva degli mRNA mediante cromatografia di affinità su cellulosa che reca un oligonucleotide costituito da residui timidilici ripetuti (TTTT...), complementari alla coda poli-A dell’mRNA (AAAA...).

Ciascuna cellula avrà un assortimento di queste molecole che riflette esattamente il repertorio di geni che erano trascritti al momento dell’analisi; il repertorio dei geni espressi può variare molto in diverse situazioni fisiologiche, in diverse fasi del ciclo cellulare, in seguito a stimolazioni con mediatori, in condizioni patologiche. Nel complesso la popolazione degli mRNA contiene le sequenze codificanti di tutti i polipeptidi sintetizzati dalla cellula in una determinata circostanza.

Ogni tipo cellulare sintetizza uno specifico gruppo di proteine (mRNAs)

1) Molti processi sono comuni a tutte le cellule, e quindi due qualsiasi cellule diverse di un organismo hanno molte proteine in comune:

- abbondanti
proteine strutturali del citoscheletro e dei cromosomi
alcune proteine essenziali del reticolo endoplasmatico e del Golgi
proteine ribosomiali

- non-abbondanti
enzimi coinvolti nelle reazioni centrali del metabolismo

2) Alcune proteine sono abbondanti nelle cellule specializzate in cui svolgono la loro funzione e non si ritrovano altrove, anche con test sensibili.

3) Le 2000 proteine più abbondanti (quelle presenti in più di 50.000 copie per cellula) sono distribuite in modo molto uniforme tra differenti tipi cellulari, e le differenze quantitative sono al massimo dell’ordine di grandezza di 5 volte; solo una piccola percentuale di proteine presenta differenze quantitative molto rilevanti in tipi cellulari diversi.

Studi del numero delle differenti sequenze di mRNA in una cellula suggeriscono che una cellula eucariotica tipica sintetizza 10-20.000 differenti proteine. La maggior parte di loro sono presenti in quantità troppo scarsa per essere rilevate dalla elettroforesi bidimensionale su gel degli estratti cellulari. Se assumiamo che queste proteine "minori" differiscono tra cellule diverse nella stessa misura di quelle più abbondanti, possiamo concludere che un numero molto piccolo di differenze tra le proteine (alcune centinaia) è sufficiente per originare differenze molto grandi nella morfologia e nel comportamento della cellula.

(dati da da Watson et al., Molecular Biology of the Cell, Chapter 9, Garland 1994)
 

Metodi di estrazione dell’RNA

- Estrazione con solventi organici (in ambiente acido)

- Affinità per matrici di silice

Il problema principale da affrontare se si vogliono ottenere preparazioni buone di RNA è rappresentato dalla minimizzazione dell’attività delle ribonucleasi liberate durante la lisi cellulare. Questi enzimi sono particolarmente potenti perché funzionano senza necessità di alcun cofattore e la loro struttura proteica secondaria può ricostituirsi anche dopo trattamento con agenti denaturanti, se l’agente denaturante viene allontanato. A tale scopo si possono impiegare inibitori delle RNasi, o usare metodi che inattivano le RNasi nel momento stesso in cui lisano le cellule. E’ anche tradizione elencare una serie di precauzioni tese ad evitare una contaminazione dei campioni da parte di sorgenti di RNasi che possono trovarsi in laboratorio. Il "Maniatis" stesso precisa che "la maggior parte dei ricercatori con esperienza non si attiene rigorosamente a queste precauzioni"; in effetti, se ne può tener conto se si incontrano problemi ripetuti di degradazione dell’RNA, ma è osservazione di vari Autori e nostra che l’impiego del metodo di Chomczynski e Sacchi (1987), che impiega un reagente fortemente inattivatore delle RNasi, non richiede l’adozione delle misure per il trattamento della vetreria e delle soluzioni (aggiunta di DEPC) impiegate nell’estrazione di RNA.

Metodi che inattivano le RNasi.

• I sali di guanidio (guanidio cloruro, guanidio tiocianato) sono tra i più potenti agenti denaturanti delle proteine conosciuti. Il guanidio cloruro è un elettrolita forte; le proteine si dissolvono prontamente in soluzioni concentrate (4M) di questo sale, perdendo qualsiasi traccia della struttura secondaria, e quindi la loro attività biologica (Cox, Methods in Enzimology XII B, p. 120, 1968). E’ importante che la soluzione sia 4M perché è stato osservato che le ribonucleasi sono ancora attive in concentrazioni 2M. Al contrario gli acidi nucleici mantengono la loro forma nativa a doppia elica persino a 70°C in questo solvente, che permette quindi di dissociare nelle distinte componenti (RNA e proteine) le ribonucleoproteine cellulari. Nello stesso tempo si ottiene una inibizione dell’azione delle ribonucleasi, che può essere potenziata dalla presenza di:

• beta-mercaptoetanolo, un agente riducente che spezza i ponti disolfuro responsabili del mantenimento della struttura, e quindi dell’attività, delle ribonucleasi. Alla dissociazione seguirà la separazione selettiva dell’acido ribonucleico.

• Temperatura: lavorare mantenendo le provette su ghiaccio (0°C) è un modo di inibire le ribonucleasi cellulari, che hanno un optimum di funzionamento alla temperatura dell’organismo.

• DEPC: il Dietilpirocarbonato (DEPC) è un potente inibitore delle RNasi che si può aggiungere alle soluzioni acquose (acqua usata per risospendere l’RNA, PBS usato per lavare le cellule etc) che si attiva dopo passaggio in autoclave della soluzione con DEPC aggiunto. Il DEPC è un cancerogeno.

• RNasin: è un inibitore biologico delle RNasi, estratto dalla placenta, che si aggiunge di solito nelle reazioni di retrotrascrizione dell’RNA per impedire la degradazione dell’RNA stesso durante il processo.