DNA > Biotech > Flight_Manual > Estrazione del DNA

The ideal tecnique

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METODI PER L’ESTRAZIONE DEL DNA

1) Nessuna estrazione

2) Estrazione
 

Spettro di applicazione:

tipo di cellule, tessuto, specie, etc

1) Tessuti umani
2) Organismi impiegati per il clonaggio di geni umani


Quantità del materiale recuperato

Qualità del materiale recuperato

• assenza di degradazione
  (indotta dalla metodica)

• assenza di prodotti contaminanti

• Funzionalità del materiale recuperato
 

Fasi della estrazione del DNA

Separazione cellulare

Lisi cellulare (detergenti; enzimi; agenti caotropici)

Dal lisato si può recuperare il DNA secondo tre modalità fondamentali:
 

1) Solventi organici

Estrazione (solvente apolare)

Precipitazione

Sali (cationi)

Solvente (solvente moderatamente apolare)

Temperatura

Gravità

Carrier

Lavaggio

Sospensione
 

2) Affinità (glass beads)

Gli acidi nucleici vanno a legarsi sulla superficie di particelle di vetro o di gel di silice in presenza di alte concentrazioni di sali caotropici (NaI, GuSCN).

La eluizione degli acidi nucleici si ottiene con soluzioni a bassa concentrazione salina.
 

3) Scambio ionico (ionic exchange: Qiagen resin)

In determinate concentrazioni saline, una matrice cromatografica con cariche positive permette il legame e la ritenzione delle molecole di acido nucleico caricate negativamente.
 
 

Controllo della estrazione del DNA

Controllo della qualità

Elettroforesi su gel
 

  • Esistenza

    •  
  • Dimensioni (>20 kb): stima relativa a bande di Marcatore

    •  
  • Integrità (assenza di degradazione)


    • Spettrofotometro

    Purificazione

    (rapporto con proteine, 260 nm/280 nm 31.8)
     

    Stima della quantità

    Elettroforesi su gel
     

  • Stima relativa a bande di Marcatore


    • Spettrofotometro
     

  • Stima per assorbanza

    •  

     

    Verifica della funzionalità

    Reazioni enzimatiche (ad es., digestione)
     
     
     
     

    Organizzazione delle estrazioni di DNA

    Schedatura

    Banca

    Conservazione

    Diagnostica clinica

    (genomico, mitocondriale, virale)

    Saliva

    Sangue

    Liquidi corporei

    Tamponi boccali, nasali, faringei, oculari...

    Tessuti

    Capelli

    Sperma

    Problemi legali
     
     

    Numeri utili

    Una cellula umana diploide contiene circa 3,3x2 (ca. 7) pg di DNA.

    1 mL di sangue periferico umano contiene ˜6-7 x 10e6 globuli bianchi.

    Massimo recupero teorico di DNA: 40-50 mg/mL di sangue.

    Quantità di DNA impiegata per il Southern blot: 5-10 mg.

    Quantità di DNA impiegata per la PCR: 0.1 mg.