L’elettroforesi su gel di agarosio o poliacrilamide è il metodo standard usato per separare, identificare e purificare frammenti di DNA e di RNA.

Questa tecnica è semplice, veloce e può risolvere frammenti che non vengono separati adeguatamente da altre procedure, come la centrifugazione su gradiente di densità (Sambrook J, Fritsch EF, and Maniatis T. Molecular Cloning. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). E’ possibile visualizzare direttamente, mediante colorazione con il colorante fluorescente bromuro di etidio ed esame in luce ultravioletta (UV), bande di DNA fino a 1-10 ng di DNA. Se necessario, le bande di DNA possono essere recuperate dal gel e sottoposte a manipolazioni enzimatiche successive.

E’ possibile versare gel in diverse forme e dimensioni; la porosità dipende dalla concentrazione di agarosio utilizzata e influenza il potere di risoluzione. Il parametro più importante da considerare è la dimensione ("size", taglia) delle molecole da separare.

I gel di poliacrilamide sono molto efficaci nella separazione di frammenti piccoli (5-500 bp), e il potere di risoluzione arriva ad 1 bp; tuttavia sono più difficili da preparare e da maneggiare, più costosi ed si ottengono con sostanze tossiche. Vanno preparati tra due lastre di vetro, in una configurazione verticale, allo scopo di impedire il contatto con l’aria (che ne impedisce la polimerizzazione) e di riuscire ad ottenere alloggiamenti (pozzetti) per i campioni da caricare in un gel molto sottile.

I gel di agarosio hanno un potere di risoluzione minore, ma una gamma di separazione molto più ampia (globalmente, da 100 bp a 50 kb; lo specifico intervallo di risoluzione varia a seconda della concentrazione di agarosio).

Normalmente la direzione e la forza del campo elettrico vengono mantenuti costanti durante la corsa. I frammenti di DNA di dimensioni maggiori, fino a 10.000 kb, possono essere utilizzati con una tecnica di elettroforesi che impiega variazioni cicliche della direzione del campo elettrico (pulsed-field, elettroforesi su gel a campi pulsanti; si rimanda a Sambrook et al., 1989).

Corrente elettrica

Il potenziale è la energia potenziale di una carica elettrica. In presenza di una differenza di potenziale (ddp), si ha un flusso netto di elettroni che costituisce la corrente elettrica. La carica elettrica che in un secondo attraversa una sezione del conduttore si chiama intensità di corrente (I) e si misura in Ampère (1 Ampère = 1 coulomb/sec; in elettroforesi di solito ci si riferisce ai milliampère, mA).

La prima legge di Ohm, la legge fondamentale dell’elettrologia, stabilisce che il rapporto tra ddp (che si misura in Volt, V) e intensità I è costante, dipendendo dalle caratteristiche del conduttore, e si chiama resistenza elettrica (R):

Ne segue che la ddp è data da

Il trasferimento delle cariche produce un lavoro, che in genere si trasforma in calore (Effetto Joule).
La potenza è il lavoro dissipato nell’unità di tempo e si misura in Watt:

Se manteniamo costante la potenza, gli altri parametri saranno aggiustati di conseguenza al variare della resistenza, ottenendosi uno sviluppo di calore costante.

Gel di agarosio

L’agarosio è uno zucchero che viene estratto dall’alga marina, ed è un polimero di unità costituite da D-galattosio e 3,6-anidro L-galattosio. Attualmente le preparazioni standard del commercio hanno quantitativi minimi di contaminanti. Forme di agarosio chimicamente modificate gelificano e fondono a basse temperature senza che si abbia perdita di resistenza meccanica del gel; tali forme vengono usate per elettroforesi preparativa del DNA e per la digestione "in situ". Sono anche disponibili preparazioni specialmente purificate di low-gelling-temperature agarose (agarosio che gelifica a bassa temperatura) che aumentano il potere di risoluzione del gel; tuttavia la risoluzione ottenuta non si può paragonare a quella dei gel di poliacrilamide.

Il "sieving agarose" ("agarosio setacciante") è un nuovo tipo di agarosio chimicamente modificato che fonde e gelifica a basse temperature (rispettivamente 65°C e 35°C). Si riesce a preparare ad alte concentrazioni (2-4%) e il suo potere di risoluzione si avvicina a quello dell’acrilamide; la gamma di separazione è di 8-1000 bp.

Parametri che influenzano la velocità di migrazione del DNA nei gel di agarosio

Dimensioni del DNA

Le molecole lineari di dsDNA migrano a velocità inversamente proporzionali al logaritmo in base 10 del numero di paia di basi. Le molecole più grandi sono sottoposte a maggiori forze di attrito, e inoltre incontrano maggiore ostacolo nel trovare una via attraverso i pori del gel rispetto alle molecole più piccole.

La relazione semilogaritmica descritta fa sì che non vi sia una spaziatura uniforme, lungo il gel, tra bande di DNA differenti tra loro dello stesso numero di paia di basi; invece, quando la dimensione delle molecole sale verso l’estremo superiore dello spettro di dimensioni analizzato, la velocità di migrazione diminuisce e il potere di risoluzione cade notevolmente.

Diagramma semilogaritmico: dimensioni del DNA (kb oppure bp) sull’asse Y logaritmico; cm oppure mm percorsi a parità di tempo sull’asse X lineare.

Concentrazione di agarosio

Esiste una relazione lineare tra il logaritmo della mobilità elettroforetica del DNA e la concentrazione del gel; questa relazione varia a seconda del valore di una costante (coefficiente di ritardo) collegata alle proprietà del gel e alla taglia e forma delle molecole migranti.

Famiglia di curve: ciascuna concentrazione di agarosio dà una particolare curva sul diagramma semilogaritmico.

Conformazione del DNA

Voltaggio applicato

Direzione del campo elettrico

Composizione in basi e temperatura

Presenza di coloranti intercalanti

Composizione del tampone di elettroforesi
 

Concetto di banda

In un gel determinato, una banda rappresenta quell’area occupata da una popolazione di molecole distinguibile da un’altra area.

Una banda può comprendere una sola specie molecolare (ad esempio l’rRNA 28S), oppure più specie molecolari che si comportino omogeneamente quanto alla migrazione.

Viceversa, una stessa specie molecolare può assumere conformazioni alternative con comportamenti migratori diversi, che ne determinano la ripartizione in bande distinte.

Il potere di risoluzione di un gel è la capacità di separare specie molecolari differenti, ed è tanto maggiore quanto minore è la differenza tra le molecole separate efficacemente.

La gamma di separazione è l’intervallo tra la dimensione più grande e quella più piccola delle molecole separabili efficacemente.
 
 

L'ETIDIO BROMURO (EtBr) assorbe i raggi UV tra 260 e 360 nm, ed emette una luce arancio a 590 nm. Proteggersi sempre gli occhi con appositi occhiali o maschere anti-UV quando si lavora con i raggi UV.

Alle basse lunghezze d'onda ha una più alta sensibilità, ma aumenta il rischio di danneggiare le molecole di DNA. 302 nm è la lunghezza raccomandata (transilluminatore UV standard per biologia molecolare).

Per monitorare l’andamento della corsa si può anche usare una lampada "manuale" a 360 nm, meno pericolosa per gli occhi.

EtBr ha una affinità bassa per il DNA a strato singolo e molto più alta per il DNA a doppio filamento.

Rallenta la migrazione di circa il 15%.

Minima quantità di DNA rilevabile come banda singola tramite fotografia di un gel colorato con Etidio Bromuro: 5 ng (1-10 ng) in un pozzetto largo 4,5 mm.

Massima quantità di DNA separabile come banda singola senza effetti di "striscio" o "trascinamento": 200 ng in un pozzetto largo 4,5 mm.

Voltaggio massimo al quale si mantiene la proporzionalità inversa tra peso molecolare e mobilità (log10): 5 volts/cm.

Agarosio Taglia del DNA lineare

%         (range in bp)

0,3        60.000 - 5.000

0,6        20.000 - 1.000

0,7        10.000 - 800

0,9        7.000 - 500

1,2        6.000 - 400

1,5        4.000 - 200

2,0        3.000 - 100